《中國藥典》2010版微生物限度檢查專題

1、微生物方法驗證，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高於(yu) 100%或者110%）。

答：沒有上限。但一般不會(hui) 高於(yu) 100%，因為(wei) 加進去的菌量是一樣的，如果超過100%可看成是操作上的誤差。按微生物的特性，如果不超過太多，是可以接受的，但沒有具體(ti) 上限。（本所控製在110%以內(nei) ）。

2、在微生物方法驗證時，黴菌、酵母菌計數驗證隻用黑曲黴及白色念珠菌做方法學驗證，在操作培養(yang) 過程中發現：在玫瑰紅鈉瓊脂培養(yang) 生長的白色念珠菌的形態太小與(yu) 營養(yang) 瓊脂上培養(yang) 的細菌的某些形態大小相同，這樣如何判斷營養(yang) 瓊脂上生長的菌落是否是白色念珠菌？為(wei) 何這兩(liang) 種菌落形態相似？

答：菌落形態相似不等於(yu) 就是同一種菌。在驗證時，營養(yang) 瓊脂的驗證菌株為(wei) 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，如果本底菌為(wei) 0，則營養(yang) 瓊脂上長的菌應該不是白色念珠菌。要判斷是否為(wei) 白色念珠菌，應進行白色念珠菌的相應鑒定方法後才能確定。任何微生物都不可能隻是從(cong) 菌落就可以進行判斷，隻能判斷為(wei) 疑似，然後再做一係列相應的鑒定實驗後才能進行判斷。

3、生孢梭菌的適宜計數用培養(yang) 基？（很多驗證需對生孢梭菌進行計數）

答：zui簡便的方法是用硫乙醇酸鹽流體(ti) 培養(yang) 基。該培養(yang) 基上層為(wei) 含氧層，適宜需氧菌生長，下層為(wei) 厭氧層（下層高度7cm以上），適宜厭氧菌生長。在培養(yang) 16~18小時這個(ge) 時間進行觀察，計數，超過20小時,由於(yu) 繁殖量大，培養(yang) 基將混濁，點計不清。或者是用哥倫(lun) 比亞(ya) 瓊脂培養(yang) 基，澆注後，置厭氧罐（袋）裏，再置培養(yang) 箱培養(yang) ，計數。

4、微生物限度檢查法中所用的培養(yang) 基要進行適用性檢查試驗，請問這些培養(yang) 基還需要做無菌檢查試驗嗎？

答：微生物限度檢查，藥典上沒有特別說明對培養(yang) 基作無菌性檢查，但每次都要做陰性對照實驗，陰性對照是檢查整個(ge) 檢驗係統是否被微生物汙染，實際上也包括了培養(yang) 基的無菌性檢查。

5、微生物限度檢查法中所用的培養(yang) 基如：營養(yang) 瓊脂、EMB、Macl等培養(yang) 基其分裝容器需要預先滅菌嗎？

答：不用。隻要是潔淨的就行，因為(wei) 分裝後還要滅菌。

6、具有抑菌性的供試品，細菌、黴菌、都是用薄膜過濾法來檢查的，那麽(me) 沙門菌可以用常規法來檢查嗎？就是可以不經過過濾直接接種到營養(yang) 肉湯中嗎？

答：這要看你驗證的結果。如果通過驗證，你的品種是對沙門菌有抑製作用，且用培養(yang) 基稀釋法不能消除其抑菌性，則就必需考慮用薄膜過濾法。

7、微生物限度檢查中，稀釋劑對照組，是在稀釋液中加入50~100cfu的菌，還是把稀釋液製成含量50~100cfu的濃度呢？

答：是把稀釋液製成含50~100cfu/ml菌的濃度。（在這裏，我對上次講課時關(guan) 於(yu) 稀釋劑對照組操作的PPT進行糾正，對於(yu) 離心 薄膜過濾法的稀釋劑對照組的操作應該是：含50~100cfu/ml菌的稀釋液     離心    取稀釋液（與(yu) 試驗組同樣取上層液）    過濾、衝(chong) 洗    貼平板）

8、稀釋級對照組:含50~100cfu/ml菌稀釋液→離心→取供試液 稀釋液過濾、衝(chong) 洗→貼平板。這裏需要加供試液嗎？是否應為(wei) 上述離心後的菌液？答：不需要取供試液，隻取“上述離心後的菌液"。關(guan) 於(yu) 這一情況，我在第7題裏已經作了說明。

9、當要做稀釋劑對照組時，是否就是從(cong) 製備供試品時就同時做一份不含供試品而是含菌50~100cfu的樣品？等於(yu) 按同一個(ge) 方法製備一個(ge) 供試品，五個(ge) 含菌稀釋液對照組？

答：是的。

10、菌落計數是否需要將每天計數的數據登記在記錄本上，是否可以隻記錄zui終的數據？

答：可以。每天計數的目的是預防菌落彌漫互相覆蓋，幹擾zui終的點計。你可以用油性筆將每天點計的數記錄在培養(yang) 皿上，發報告時隻要zui終菌落數就行了。

11、若樣品中有不溶物（如片劑中的輔料顆粒），經常會(hui) 影響培養(yang) 前期的結果，藥典要求逐日計數，所以報告中會(hui) 出現第二、三日菌落數小於(yu) *日的現象，請問該如何向客戶或監檢機構解釋這種結果？或者是否可以不計*、二日菌落數，待輔料顆粒與(yu) 菌落可以區分後再計數？

答：報告書(shu) 不需要顯示*、第二天的結果，隻需報告zui終結果。理由請見第9題答複。或者是在營養(yang) 瓊脂中加入TTC試劑（每100ml加入0.1%）

12、由於(yu) 微生物檢驗的特殊性，對於(yu) 樣品的微生物限度檢查計數數據是否可登記在表格內(nei) （此表格僅(jin) 含樣品名稱、批號及檢查結果）。之後再將檢測結果移至詳細記錄中？

答：原始記錄應該隻有1份。如果你說的詳細記錄是屬於(yu) 一般記錄，是沒有必要的，如果是指報告書(shu) ，就應該沒問題。這要看你自己訂的SOP。

13、直接接種法培養(yang) 後的菌落報告：原液230cfu,稀釋10倍後 40cfu,請問按2010版藥典的菌落數報告規則如何報告菌落數？

答：報告菌落數為(wei) 40×10=400cfu。應以菌落數乘以稀釋倍數後的zui大值作為(wei) 報告結果。

14、05版藥典供試品離心5分鍾，而10版藥典改用離心3分鍾，原來按5分鍾驗證的產(chan) 品是否需要重新驗證？

答：是的。需要再確認一下。

15、10版藥典附錄微生物限度檢查法中結果判斷的菌落計數單位是以“cfu"表示，但正文品種項下是以“個(ge) "表示，zui終應以哪位為(wei) 準呢？

答：應該是以cfu為(wei) 單位。正文是由於(yu) 印刷時沒統一修改過來，關(guan) 於(yu) 這個(ge) 問題，在增補本上修訂過來。（在增補本沒出來之前，正文品種還是以個(ge) 為(wei) 單位）

16、為(wei) 何控製菌液的濃度為(wei) 50-100cfu/ml。

答：50-100cfu在平板上比較好點計，菌落不容易重疊。少於(yu) 50，則實驗誤差會(hui) 增大，重現性不好，大於(yu) 100則容易造成菌落太密或重疊不好計數。

17、藥典上控製菌檢查的方法驗證，隻是說把菌加至增菌培養(yang) 基中檢出即可，那我們(men) 實際做驗證與(yu) 記錄時，是否要做增菌以後的步驟呢？

答：要。不然你怎麽(me) 知道檢出來的菌是你加進去的試驗菌呢？

18、采用薄膜過濾法檢驗，陽性菌，計數是否也用此方法計數？

答：是的。

19、對於(yu) 10版藥典延長培養(yang) 時間，控製菌35-37℃改為(wei) 30-35℃培養(yang) 溫度，一些已經驗證（按05版藥典）檢品是否需要重新驗證？是否有必要進行延長時間前後菌生長情況變化的驗證試驗？

答：目前沒有相關(guan) 性規定，我們(men) 認為(wei) 可按原來已經驗證的方法，用2010年版的培養(yang) 時間和溫度再確認一下，如果結果符合藥典要求，則可用。如果不可行，則調整後再進行驗證。

20、若無需都重新驗證，那麽(me) 參照標準為(wei) 05版藥典，又可以通過什麽(me) 文件來更改為(wei) 參照10版藥典？

答：請看上一題。

21、檢驗控製菌用培養(yang) 基促生長能力的檢查，也需要對照培養(yang) 基嗎？例如：大腸埃希菌用的BL增菌液。

答：是的。請看附錄“微生物限度檢查法"中的表2。

22、10版藥典增加貼膏劑的檢查，狗皮貼膏藥屬於(yu) 貼膏劑嗎？

答：應該是的。請對照《中國藥典》一部附錄P8進行確定。

23、請問若試驗條件限製未能使用勻漿儀(yi) 製備非規定滅菌製劑是否可采用溫熱（不超過45℃）的稀釋液？

答：如果能夠充分分散樣品，可以的。

24、請問若采用薄膜過濾法進行驗證，由於(yu) 過濾難度大，是否可以每膜過濾相當於(yu) 供試品0.1g，報告以結果乘以10？

答：驗證計數時可以的，驗證控製菌時檢驗總量應達到藥典要求，如果一張膜檢驗量達不到，可分幾個(ge) 膜。

25、請問采用靜置分層取上清液薄膜過濾，是否需要加稀釋劑對照組？

答：個(ge) 人觀點可以不用,但未經驗證。

26、供試品靜置分層取上清液進行試驗，靜置3~5分鍾，是否經過驗證供試品的本底菌不會(hui) 沉到底部？

答：未經驗證。

27、培養(yang) 基適用性檢查，抑製能力檢查用菌種是哪些？

答：控製菌的培養(yang) 基適用性檢查,請看藥典“微生物限度檢查法"中表2，計數用培養(yang) 基請看“計數培養(yang) 基的適用性檢查"。

28、投料中有神曲提取物，限度應界定為(wei) 多少？

答：不是藥材原粉投料，標準均按“不含藥材原粉的製劑"執行。

29、微生物限度檢查裏有關(guan) 經驗類的東(dong) 西都必須經過驗證才可以使用,那麽(me) 驗證的內(nei) 容包括哪些數據應記錄，是否也應該有文件與(yu) 記錄？

答：參照藥典，你是作什麽(me) 樣的檢驗，就作什麽(me) 樣的驗證，有驗證就應該有記錄。

30、比如10倍稀釋級菌落數為(wei) 0，100倍稀釋級菌落數為(wei) 2，按2005年版藥典應以低稀釋級菌落數報告為(wei) ＜10，還是按zui高平均菌落數乘以稀釋倍數報告為(wei) 200個(ge) /g，是否理解正確？

答：按《中國藥典》2005年版報告應為(wei) ＜10個(ge) /g（或ml），按《中國藥典》2010年版報告應為(wei) 200cfu/g（或ml）。

31、計數方法的驗證：執行新版藥典是否就延長培養(yang) 時間做方法驗證？

答：是。

32、平皿法中提到“每個(ge) 稀釋級每種培養(yang) 基至少檢驗2ml供試液"，是每皿注2ml還是每皿注1ml？如要做0.5ml或0.2ml，本級是否還需做1ml?答：常規平皿法時每皿注1ml，做2個(ge) 皿；培養(yang) 基稀釋法（即每皿0.5ml或0.2ml）時，供試液總量也應是2ml，每1ml菌落數合計後，2ml的菌落數再平均；本級就不需做1ml了，但下一級就隻做1ml/皿就行了。

33、在細菌黴菌計數檢查中，老師提到的每個(ge) 稀釋級每種培養(yang) 基至少檢驗2ml供試液，但2010版藥典上並沒有要求要這樣做，那應以哪個(ge) 做法為(wei) 準？

答：藥典中對平皿法的描述：平皿法“取供試液1ml，置直徑90mm 的無菌平皿中，注入15～20ml 溫度不超過45℃的溶化的營養(yang) 瓊脂培養(yang) 基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yang) 基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養(yang) 基，混勻，凝固，倒置培養(yang) 。每稀釋級每種培養(yang) 基至少製備2 個(ge) 平板。"這裏的描述是以常規平皿法進行描述的，所以“每稀釋級每種培養(yang) 基至少製備2 個(ge) 平板"，也就是2ml的量。對於(yu) 培養(yang) 基稀釋法，請看藥典供試液的製備中3. (6) ①。

34、10版藥典要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml，（其中10g或10ml用於(yu) 陽性對照試驗）是否指20g或20ml樣品中10g或10ml直接用於(yu) 沙門菌控製檢查，另10g或10ml加pH7.0的緩衝(chong) 液100ml作為(wei) 1：10的供試品溶液作為(wei) 細菌，黴菌，酵母菌的檢驗嗎？還是指20g都用於(yu) 沙門菌檢查？

答：20g都是用於(yu) 沙門菌檢查。沙門菌的檢查法是：取3份200ml營養(yang) 肉湯，其中2份分別加入10g或10ml樣品，取其中1份加入10~100cfu菌液作陽性對照。第3份加入10ml稀釋劑作陰性對照進行檢查，所以。細菌，黴菌，酵母菌檢驗的樣品不包括在這裏。

35、沙門菌檢查為(wei) 10g或10ml，為(wei) 何一次檢查量又為(wei) 20g或20ml？（P130）答：其中10g（或10ml）是檢驗用的，另10g（或10ml）是用於(yu) 陽性對照試驗的。請看上一題目解釋。

36、采用薄膜過濾法時，濾膜采用何種方法滅菌？

答：據我們(men) 經驗，采用一次性18新利吧。如果用多次使用的18新利吧，則濾膜用濕熱滅菌比較好，因為(wei) 幹熱滅菌後，濾膜較脆，試驗時不容易保證濾膜完整。

37、方法學驗證時，采用平皿法稀釋級計數，是否要做稀釋級對照組？

答：稀釋級對照組？是指本底菌組嗎？如果是，那就要。因為(wei) 要平行試驗，才能知道同一稀釋級的本底菌是多少。如果是指稀釋劑對照組，就不用，因為(wei) 所用的稀釋劑是藥典規定的，是無毒性的稀釋劑。

38、方法驗證的培養(yang) 基稀釋法驗證（樣品0.2ml）隻做2個(ge) 平皿，每個(ge) 平皿的加菌量是多少？如果同步加0.2ml菌，其加菌量就達不到50~100cfu。

答：不管每皿加的供試液的量是多少，每皿加菌液的量都是1ml ,即都是50~100cfu。

39、平皿法（稀釋法）計數驗證時，取zui低稀釋供試液如0.5ml和50~100cfu試驗菌，那50~100cfu的試驗菌是指50~100cfu還是50~100cfu∕0.5ml？我們(men) 是要加1ml還是0.5ml的試驗菌？

答：平皿法（稀釋法）計數驗證時，每皿要加的菌液是50~100cfu，一般我們(men) 配製的菌液濃度是50~100cfu/ml，所以就加1ml。如果你配製的菌液不是這個(ge) 濃度，你可以折算，隻要加的菌數是50~100cfu/皿就行了。

40、細菌黴菌方法驗證，同時做1ml，0.5ml，0.2ml供試品組及供試品驗證組時，菌液是否也按1ml，0.5ml，0.2ml分別加入？此時1ml，0.5ml，0.2ml供試品驗證組中的菌數能否也達到50~100cfu？

答：驗證時，不論是1ml，0.5ml，0.2ml的供試液，每皿的加菌量都是50~100cfu，即1ml（如果你配製的菌液濃度是50~100cfu/ml）。

41、培養(yang) 基稀釋方法驗證，每皿0.2ml，加菌液0.2ml，那麽(me) 0.2ml的菌液計數是否在50~100cfu∕0.2ml。

答：請看上一題的解釋。

42、微生物限度檢查黴菌、酵母菌要求不超過100的情況下，這兩(liang) 種菌是不是要分開來檢，用不同培養(yang) 基檢測？目前隻用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yang) 基檢測這兩(liang) 種菌，有沒有必要修改？

答：按藥典規定，一般品種是用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yang) 基檢測這兩(liang) 種菌；含蜂蜜、王漿的液體(ti) 製劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yang) 基測定黴菌數，用酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養(yang) 基測定酵母菌數，合並計數。

43、測表麵微生物時，直接接觸藥品與(yu) 間接接觸藥品的限度（≤25）一致，是否有不妥，如果有不同意見，可否提供其計數方法？另外，如果檢測到菌落數超過100以上，那麽(me) 報告規則的菌數也是取兩(liang) 位有效數字嗎？

答：“測表麵微生物"？這應該是藥包材的檢測標準吧？由於(yu) 我們(men) 尚未開展這項業(ye) 務，所以對其標準情況不了解，但既然已經成為(wei) 標準，就肯定有其合理性，如有不同意見，可向標準製訂部門反映，並提出你認為(wei) 合理的解決(jue) 辦法。微生物的報告規則一般都是取兩(liang) 位有效數字。

44、內(nei) 包裝材料PVC硬片，鋁箔等樣品的微生物檢驗（限度）方法？

答：是藥包材的檢驗？應該有相應的檢驗方法吧！

45、控製菌檢查，大腸埃希菌IMViC試驗，結果顯示未檢出，有沒有硬性規定必須要進一步鑒定？

答：對於(yu) 大腸埃希菌檢查，IMViC試驗已經是鑒定試驗了，如果IMViC試驗結果顯示未檢出，那麽(me) 就可以報告未檢出大腸埃希菌。

46、菌數報告按兩(liang) 位有效數字報告，是按數字修約方法進行數據修約，還是隻用保留兩(liang) 位有效數字，如菌數為(wei) 364報告菌數為(wei) 360，還是370；若菌數為(wei) 3670報告菌數應為(wei) 多少？

答：修約原則是4舍6入5留雙。即菌數為(wei) 364報告菌數為(wei) 360；若菌數為(wei) 3670報告菌數應為(wei) 3700；如果是3650，則報告菌數應為(wei) 3600。

47、在日常檢驗中控製菌檢驗方法通過驗證的控製菌檢驗可否不做陽性對照？理解：在驗證時已做過控製菌 供試液，驗證時供試液對控製菌無抑菌性，若隻是做控製菌（不加供試液）則在培養(yang) 基適用性時已證明培養(yang) 基的質量，那麽(me) 每次試驗做陽性對照的意義(yi) 是什麽(me) ？或者陽性對照試驗怎麽(me) 做？

答：從(cong) 理論上來說是可以的，驗證試驗實際上就是檢驗時的陽性對照試驗。但藥典要求控製菌檢查時必需同時從(cong) 陽性對照和陰性對照，這應該是考慮到檢驗過程的檢驗係統的誤差吧。本人認為(wei) ，生產(chan) 廠家對自己的產(chan) 品在經驗證後，檢驗時如果每天同一產(chan) 品批量很大，可以隻做一個(ge) 陽性對照，但對於(yu) 藥檢所則必須每批都做，因為(wei) 對於(yu) 同一品種，不同廠家其生產(chan) 工藝不盡相同，在檢驗過程中對被檢微生物的幹擾也不同。因此，藥檢所應每批都做。

48、取樣量藥典要求“從(cong) 2個(ge) 以上zui小包裝單位中抽取供試品"，是否包括2個(ge) ？

答：包括。

49、請問藥廠自行做的微生物方法驗證是否需要經過藥檢所的審核？若產(chan) 品更改為(wei) 輔料，重新做方法驗證，是否需要到藥檢所備案或需要藥檢所審核？

答：藥廠自行做的微生物方法驗證不需要經過藥檢所的審核。同樣，重新驗證後也不需要。但如果你的檢品需要報注冊(ce) 檢驗，則你必需提供你的整個(ge) 驗證資料，藥檢所將根據情況對你的方法進行確認，看方法是否可行。

50、是否每次做培養(yang) 基適用性都必須與(yu) 對照培養(yang) 基進行比較？如果*批培養(yang) 基與(yu) 對照培養(yang) 基比較回收率為(wei) 90%，那麽(me) 第二批培養(yang) 基與(yu) *批培養(yang) 基比較回收率為(wei) 80%，則折算為(wei) 第二批培養(yang) 基與(yu) 對照培養(yang) 基比較回收率為(wei) 72%，之後購買(mai) 的培養(yang) 基與(yu) 前一批比較，而不用每次培養(yang) 基適用性都與(yu) 對照培養(yang) 基比較，這樣可不可行？

答：請按藥典要求做，至於(yu) 內(nei) 部控製則要自己掌握。但你要保證*批培養(yang) 基在你用於(yu) 與(yu) 第二、第三批比較時，質量保持其與(yu) 對照培養(yang) 基比較時一樣，因為(wei) 隨著時間的推移，培養(yang) 基的質量肯定有所下降。

51、微生物檢驗驗證時，如我用一瓶普通脫水培養(yang) 基與(yu) 對照培養(yang) 基測定菌落數，如普通脫水培養(yang) 基符合適用性檢查，那麽(me) 該瓶普通脫水培養(yang) 基能否作為(wei) 以後工作中的對照培養(yang) 基來用？

答：請看上一題的解釋。

52、培養(yang) 時間有要求24~48h，也有要求24~72h的，像這種時間要求範圍比較大的情況，如果在zui短的時間內(nei) （如：24h）就已經長菌，但需進行後續實驗判斷該菌是否為(wei) 控製菌，那麽(me) ，是否需要培養(yang) 到zui長時間（如：48h或72h）再進行後續實驗？

答：長勢好的話可以進行後續實驗不用等到zui長時間。

53、操作結果的RSD%的範圍比較寬裕，是否可信？（eg：黑曲黴若＞20cfu∕皿時，菌落將擴散至難以分離，所以回收率度較低）

答：這個(ge) 問題要具體(ti) 問題具體(ti) 分析。菌落漫延，這是要求逐日觀察的主要原因之一，應在菌落能分辨的時候點計菌落數。加菌量太少，容易出現誤差大，重現性差，所以要求加的菌數在50~100cfu。

54、含藥材細粉的膠囊如何製備供試液？

答：按固體(ti) 製劑供試液的製備方法製備，可用45℃水浴軟化溶解膠囊殼。

55、大腸菌群檢查，需陽性對照嗎？

答：要的。陽性對照菌為(wei) 大腸埃希菌。

56、菌液塗布時，用接種棒還是塗布棒塗？

答：用L型塗布棒，也可用玻棒自製。

57、控製菌的培養(yang) 基促生長能力檢查，對照菌加於(yu) 固體(ti) 培養(yang) 基如何塗布，用什麽(me) 工具來塗布？

答：請看上一題。

58、三部藥典中有些產(chan) 品細菌數、黴菌和酵母菌數用每g多少cfu，但有些為(wei) 每g多少個(ge) ，應怎樣記錄？

答：應該是cfu才對的，這些應該是在轉版時沒轉過來吧，在增補本應該會(hui) 轉過來。但是在沒轉過來之前，它還是法定的，必需按藥典上的寫(xie) 法來執行。

59、如樣品的控製菌為(wei) 大腸埃希菌沒檢出，但檢出其它種菌，結果該怎樣判定？

答：如果是其他致病菌，請看微生物限度檢查法的結果判斷*句。

60、我們(men) 是做糖衣片的，微生物限度檢查吸取供試液時，吸管有時會(hui) 被粉末塞住，那能不能讓供試液沉澱後取其上清液呢？這樣操作結果可靠嗎？

答：請將藥片盡可能打碎，如果還不能解決(jue) 問題，我們(men) 的經驗是：可讓大藥渣沉降後取上層液進行試驗，但沉降時間盡可能短(在3-5分鍾內(nei) )，這樣做對結果會(hui) 有一定影響，但應該在可接受範圍內(nei) 。

61、微生物限度檢查控製菌檢查時，如供試液的增菌後無菌生長，可否直接發供試液的未檢出控製菌，此時，陽性對照試驗還需繼續做下去嗎？

答：隻要能判定供試液增菌後無菌生長，陽性對照試驗菌長出，就可發未檢出控製菌。

62、如何理解“菌落蔓延成片不以計數"？如10-1級有1個(ge) 皿的菌落成片是否用10-2級來計數？

答：是的。

63、如何避免菌落成片？

答：1、培養(yang) 基傾(qing) 注時溫度不宜過高，可減少傾(qing) 注後培養(yang) 皿裏的水蒸汽太多而造成菌落容易漫延，或者加蓋“陶瓦蓋"吸收水蒸汽；2、細菌計數時，在每100ml營養(yang) 瓊脂培養(yang) 基中加入滅菌的1%氯化四氮唑0.1ml，可使生成的菌落變紅色，容易點計，也可在一定程度上抑製菌落漫延。

64、請問一下對於(yu) 生長速度快、易蔓延的菌有什麽(me) 好的方法控製，該如何計數，如采用陶瓦蓋培養(yang) 時間要不要延長？

答：請看上一題的說明。如用陶瓦蓋，培養(yang) 時間不需要延長。

65、請問若細菌、酵母菌平均菌落數不在其宜選取的範圍內(nei) ，即大於(yu) 300及100cfu時，該如何報告菌數？另05版藥典的規定範圍是30~300/30~100，倘若當菌落數大於(yu) 300及100，如何報告？

答：應該重新試驗，將稀釋級再往進一步稀釋，直到能有可報告的稀釋級。可在工作中以對產(chan) 品的認識將稀釋級調整到可報告的級別進行檢驗。

66、請問對於(yu) 抑菌性難以消除的粉末狀樣品，采用的消除抑菌性的方法是什麽(me) ？

答：如果能溶於(yu) 水，目前來說，的除菌方法是薄膜過濾法；其次是找到相應的中和劑。

67、我們(men) 生產(chan) 的產(chan) 品為(wei) 外用搽劑非無菌產(chan) 品，需要對所有原輔料做微生物限度檢查嗎？

答：生產(chan) 企業(ye) 對原輔料的微生物限度檢查，應根據自己的情況進行控製。參見一部附錄P88（或二部附錄P116），微生物限度標準 第7點。（個(ge) 人意見：如果所用的原輔料直接投料，就要控製，如果還要進一步提取等，則可通過控製中間產(chan) 品的微生物限度來控製。）

68、原輔料是否要單獨做方法驗證？

答：所有要檢查微生物限度的品種（當然包括原輔料），都要做方法驗證。

69、中藥材的微生物限度如何檢測？如超標應如何控製？

答：1.中藥材的微生物限度檢查，參照固體(ti) 製劑的供試液製備，並根據給藥途徑執行標準，如用於(yu) 直接投料至口服製劑的，還應檢大腸菌群。2.如超標，具體(ti) 問題具體(ti) 分析。

70、中間產(chan) 品可否不做微生物檢測？

答：中間產(chan) 品應該控製微生物限度，各企業(ye) 應內(nei) 部質控相關(guan) 的具體(ti) 要求。

71、廠家用10-2稀釋級作驗證，那我們(men) 藥檢所作檢查時是否從(cong) 10-2稀釋級開始做？

答：是的。

72、省所做微生物限度時，廠家沒有做驗證，那省所是自己做驗證，還是退回去？又或者廠家的控製菌驗證沒有做全（例如漏了沙門菌沒做），那省所怎麽(me) 處理？

答：1、如果是注冊(ce) 檢驗，廠家沒有做驗證，我們(men) 是不會(hui) 接收樣品的，也就是說，沒做驗證或驗證不全，肯定退回去。 2、如果是委托檢驗，由於(yu) 是協議性質，我們(men) 就按協議進行檢驗。

73、微生物限度檢查時，隻有細菌數不合格，那麽(me) 複試是否可以隻做細菌數檢查就行了？

答：可以。

74、樣品製備中，如羧甲澱粉鈉等崩解劑遇水膨脹，經試驗1g∕100ml仍為(wei) 膠體(ti) 漿糊狀，無法過濾且難與(yu) 培養(yang) 基融合，再加大稀釋倍數，則代表量太少，請問這種輔料采用何種方法進行微生物限度檢查？

答：羧甲澱粉鈉應該沒有抑菌作用，無法過濾可用平皿法進行檢查，且供試液製備時，稀釋劑的溫度適當調低些。

75、若樣品對微生物生長有促進性，采用薄膜過濾法應如何消除此影響，或者有什麽(me) 其他方法可以消除促進性以獲得更準確結果？

答：采用薄膜過濾法就是很好的消除影響的方法；藥典上規定“供試液從(cong) 製備到加入檢驗用培養(yang) 基不得超過1個(ge) 小時"，就是考慮到樣品對微生物存在促進或者抑製作用的影響。因此要獲得更準確的結果，就必需盡量縮短從(cong) 供試液的製備到加入培養(yang) 基的時間。另外，也可根據樣品的特性有針對性的加入中和劑等。

76、控製菌檢查對於(yu) 大腸的檢查，MUG試驗中顯陽性或難以判斷時，“將培養(yang) 液轉接到EMB"，這裏的培養(yang) 液是指MUG還是之前擴增的BL？

答：藥典上並沒有“將培養(yang) 液轉接到EMB"這一描述。但對於(yu) MUG和靛基質試驗結果不一致時，是這麽(me) 規定的：“如MUG 陽性、靛基質陰性，或MUG 陰性、靛基質陽性，則應取膽鹽乳糖培養(yang) 基的培養(yang) 物劃線接種於(yu) 曙紅亞(ya) 甲藍瓊脂培養(yang) 基或麥康凱瓊脂培養(yang) 基的平板上，培養(yang) 18～24 小時。"

77、膽香鼻炎含有豬膽汁膏，毛雞藥酒含有毛雞浸出夜，霍膽丸含豬膽粉，這三個(ge) 產(chan) 品需要檢沙門菌嗎？

答：是的。（因含豬膽汁膏、毛雞、豬膽粉）。

78、微生物檢驗時，勻漿機應把轉速調到多少才不會(hui) 對微生物有損傷(shang) ？

答：沒有相關(guan) 的規定，目前一般使用轉速為(wei) 3000-4000轉/分鍾。

79、如果使用藥典以外的培養(yang) 基進行微生物限度檢查（比如TSA），怎麽(me) 進行培養(yang) 基適用性檢查，是否有合適的對照培養(yang) 基？

答：可以參照“藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則"對所用培養(yang) 基的質量進行控製。至於(yu) 是否有相應的對照培養(yang) 基，要看中檢所是否來得及研製。

80、微生物限度檢查的方法驗證，至少應進行3次獨立平行試驗，每個(ge) 獨立平行試驗可否使用不同批號的樣品？

答：可以，且是用3個(ge) 不同批號樣品進行驗證。

81、每個(ge) 獨立的平行試驗是否有必要用3個(ge) 不同批號的樣品進行驗證？

答：用3個(ge) 不同批號的樣品進行驗證，可以增加驗證結果的重現性。

82、微生物限度檢查中，培養(yang) 基的適用性檢查時對每個(ge) 批號的培養(yang) 基進行還是對每次製備好的培養(yang) 基進行？

答：請看《藥品微生物實驗室規範指導原則》中，關(guan) 於(yu) 培養(yang) 基第3點，質量控製試驗的描述：“除藥典附錄另有規定外，在實驗室中，若采用已驗證的配製和滅菌程序製備培養(yang) 基且過程受控，那麽(me) 同一批脫水培養(yang) 基的適用性檢查試驗可隻進行一次。如果培養(yang) 基的製備過程未經驗證，那麽(me) 每一批培養(yang) 基均要進行適用性檢查試驗，試驗的菌種可根據培養(yang) 基的用途從(cong) 相關(guan) 附錄中進行選擇，也可增加從(cong) 生產(chan) 環境及產(chan) 品中常見的汙染菌株。"

83、能否舉(ju) 例說明哪些培養(yang) 基是指示能力檢查培養(yang) 基？

答：請看“微生物限度檢查法"中表2。

84、05版SOP中有說經驗證後控製菌可以不用做陽性對照，10版是否有相同的說法？已建立控製菌方法是否還需作陽性對照？

答：藥典規定，控製菌檢查必需同時檢查陽性對照和陰性對照。05版SOP《中國藥品檢驗標準操作》中並沒有說經驗證後控製菌可以不用做陽性對照，不知你所說的是那個(ge) SOP？

85、請問化藥軟膠囊還需要檢沙門菌嗎？

答：如果是口服製劑、有動物藥投料就必需檢查。

86、微生物方法驗證過程中，供試液的製備，檢細菌與(yu) 黴菌及酵母菌處理不一樣，這樣方法是否能成立？

答：*有可能。檢查方法是經驗證的，對於(yu) 有抑菌作用的品種，經驗證後細菌計數方法與(yu) 黴菌及酵母菌的檢查方法不一樣，這很正常，隻要方法是經驗證，符合藥典要求就可以。

87、2010版藥典控製菌培養(yang) 溫度降低到30~35℃，那麽(me) 以2005版藥典驗證過程控製菌檢驗方法，2010版藥典還需要再驗證嗎？

答：是的。

88、檢大腸埃希菌時，MUG觀察一定要5小時觀察，是否可以隻在24h觀察？

答：可以。

89、培養(yang) 基適用性檢查塗布時如何考慮（或消除）塗布棒上沾到菌落的影響？

答：塗布時，試驗用培養(yang) 基與(yu) 對照培養(yang) 基都同樣操作，所以這個(ge) 影響是同等的，可不需考慮。

90、純化水要多少ml過濾，是不是原液要不要衝(chong) 洗液衝(chong) 洗？要不要陰性對照？

答：過濾多少ml可根據樣品微生物汙染的程度來決(jue) 定，隻要zui終每膜上的菌落不超過點計要求（即100cfu）就行了，結果報告時將菌落數除以ml數即可。可以不用衝(chong) 洗。必需做陰性對照。

91、用稀釋法檢驗控製菌的時候，金黃色葡萄球菌是10ml（相當1g，1ml）至500ml肉湯，能否用2ml至100肉湯？

答：可以，但應該同時做5份，使檢驗用的樣品總量達到1g（或1ml）。

92、保留2倍有效數字（細菌，黴菌報告數）如果檢出細菌是1160cfu/g，是否報告數必須寫(xie) 成1.1*103cfu/g，還是直接寫(xie) 1/100（不過這樣好像不是2倍有效數字）。

答：報告數應該寫(xie) 成1.2Χ103cfu/g或1200cfu/g。

93、怎麽(me) 證明微生物限度中加入的表麵活性劑，中和劑或滅活劑的生長和存活無毒性？是在驗證中做稀釋劑對照組就可證明是否其無毒性了嗎？還是？

答：是的，在驗證中做稀釋劑對照組就可證明是否其無毒性。

94、平皿稀釋法時，若每一個(ge) 平皿加入0.5ml供試液，那麽(me) ，陰性也是加0.5ml嗎？還是陰性加1ml？

答：陰性是檢驗檢測係統是否受微生物汙染的試驗，應該是取1ml稀釋液。

95、輔料中的香精（如楊梅香精），滑石粉是否按非水溶性製劑供試品處理？氫氧化鈉又如何處理呢？

答：香精和滑石粉，如果能分散於(yu) 水中，或者加表麵活性劑後能分散於(yu) 水中就可以，不一定非要按非水溶性製劑製備供試液。氫氧化鈉可溶於(yu) 水，可按普通檢品檢驗進行驗證處理。

96、有兩(liang) 種製劑形式的原料藥該如何製定衛生學指標呢？如一種原料藥可用於(yu) 口服製劑以及外用製劑？

答：可以按要投料的劑型進行控製，或者直接按要求嚴(yan) 格的一種來要求。